DNA Klonlama Metodu Olan PCR Testi Tam Olarak Nedir ve Ne İşe Yarar?
1) nedir bu pcr?
dna'nın belirli bir segmentinin çoklu kopyalarını yapmak için moleküler biyolojide yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. metot basitçe tüp içerisinde dna'nın uygun koşullarda çoğaltılması esasına dayanır. bu metot ile kısa süre içerisinde çok küçük miktarda dna baz dizisinden milyonlarca dna parçacığı çoğaltmak mümkündür.
bir çeşit "in vitro klonlama" olarak da tanımlanan pcr; 94 °c-98 °c aralığında gerçekleştirilen denaturation, 37 °c-65 °c aralığında gerçekleştirilen annealing ve 72 °c’de gerçekleştirilen elongation aşamalarından oluşur ve bu döngülerin belirli sayıda tekrarlanarak dna'nın üssel olarak katlanmasına dayanır.
pcr yaygın olarak kalıtsal hastalıkların teşhisi, genetik parmak izlerinin tanımlanması, bulaşıcı hastalıkların teşhisi, genlerin klonlanması, babalık testi ve dna hesaplaması gibi çeşitli konularda yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. ayrıca pcr'a dayalı rapd, aflp, ssr ve ıssr gibi markör teknikleri geliştirilmiştir. bu teknikler birçok bitki ve hayvanda tür içi ve türler arası genetik akrabalığın teşhisinde kullanılmaktadır.
(bkz: polymerase chain reaction)
2) detaylandıralım
hani kan sayımı yaptıracağınız zaman bir tüp kan verirsiniz, o tüpü makineye sokarlar, czırt cızrt czırt, makine size sonuçları verir ya, hah, işte öyle bir test değildir.
pcr testi (aslında real time pcr veya qpcr, rtpcr değil) bildiğiniz kontrollü deney protokolüdür. 3 kere tekrarlarsınız. her tekrarda bir sayısal değer elde edersiniz. elinizde, test ettiğiniz örneğe dair bir averaj değer ve bir standart sapma olur. sadece bu sayılara bakarak şahsın pozitif olup olmadığına karar veremezsiniz, çünkü bu deney düzeneği, standart değerler veren bir teknik değildir (hani kan şekeri için şu şu aralık normaldir, bundan yukarısı yüksektir diye kabul ettiğimiz bir standart var ya, o burada yok. her deneyin sonucu birbirinden bağımsız çıkıyor, şu değer çıkarsa pozitif, bu değer çıkarsa negatif diyemiyorsunuz). ayrıca aynı örneği, aynı malzemelerle, aynı koşullarla tekrar tekrar yapsanız tekrar tekrar farklı sayılar elde edersiniz. bu yüzden istatistiki karşılaştırmaya gerek var.
peki bu durumda n'apıcaz?
aynı koşullarda uygulanmış bir negatif kontrole ihtiyaç var. (aslında moleküler biyolojinin her aşamasının vazgeçilmezidir negatif kontrol. matematikteki sıfır gibi, o olmadan hiç bi şey anlamlı olmaz). aynı koşullarda denediğiniz, virüs taşımadığınız bildiğiniz örneği (negatif kontrol) ve test ettiğiniz örneği üçer kere pcr ile çoğaltırsınız. sonra iki grubun averaj ve standart sapma değerlerini karşılaştırarak farklı olup olmadığına karar verirsiniz. aralarındaki fark küçükse ve istatistiki olarak anlamlı değilse, sonuç negatiftir. aradaki fark büyükse ve istatistiki olarak anlamlıysa, sonuç pozitiftir. bu testin hata payının yüksek olmasının sebebi bizatihi bu. hatta bazı durumlarda hastanın öyküsünü de hesaba katarak test sonucuna manuel karar vermek gerekebiliyor.
peki neden pcr yapıyoruz?
çünkü pcr yapmadan virüsün varlığını bilemeyiz.
ağzınızdan, burnunuzdan ve burnunuzun derinliklerinden alınan örneklerde virüs rna'sının olup olmadığına bakıyorlar. virüs rna'sının sekansı bizim rna'larımızın sekanslarından oldukça farklı. yoksa molekül aynı molekül. bu sekans farklılıklarını kullanarak virüsün rna'sını çoğaltıyor pcr testi.
peki neden çoğaltıyor? çünkü örnek içinde aldığınız virüs rna'sı miktarı çok az, 3 kopya 5 kopya (attım). o kadar az rna'yı elimizdeki tekniklerle gözlemlememiz mümkün değil. dediğim gibi, bunların hepsi rna molekülüi öyle rna boyama gibi bi işlem yaparsak en çok kendi rna'larını görürüz. virüsün rna'sını gözlemleyebilmek ve varlığından emin olabilmek için, diğer rna'ları değil, sadece ve sadece virüsün rna'sını, özel olarak, enzim yardımıyla çoğaltıyoruz. şu anda uygulanan pcr testi bu.
şimdi bu çoğaltma olayı biraz sıkıntılı
testin güvenilirliğinin düşük olmasının nedenlerinden biri o zaten. hedefi her zaman tutturamıyoruz. bazen hedefi yakalayamayıp az çoğaltıyor, bazen hedef dışı rna'ları yakalayıp onları da çoğaltıyor. bu hedefleme işi, koşulları değiştirerek bu hedefleme optimize edilebilir. mesela kullanılan primer'lerin sekansı değiştirebilir, sıcaklık, süre, konsantrasyon vs. değiştirilerek optimal güvenilirliğe ulaşılabilir. çoğaltma işlemi için kullanılan makine, hatta deney yapılan ortamın, alet edevatın temizlik seviyesi bile sonucu etkiler.
ha şu an türkiye'de uygulanan koşullar en güvenilir pcr koşulları mıdır? bilmiyorum. her real time pcr'ın false positive ve false negative sonuçları vardır ama en iyi koşulları bularak bunları en aza indirebiliriz.
bir de pcr mükemmel yapılsa bile örneklemeden gelen sıkıntılar var. siz bu örneği hastanın ağzından burnundan alıyorsunuz. hatalığın ilk evresi değilse ağız burun çoktan temizlenmiş, virüs akciğerlere inmiş olabilir mesela. bu da false negative sebebi. herkesin akciğerine delip açıp örnek alamayacağımıza göre...
mesela bakın şurada sonucu nelerin etkileyebileceğini tane tane anlatmış:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/…/articles/pmc7189409/
fda'nın bu konudaki cevapları da şurada:
https://www.fda.gov/…evices/faqs-testing-sars-cov-2
ama maalesef türkiye'de uygulanan parametrelerle ilgili şeffaf bir açıklama yapılmadı.
şu da yine faideli bi link, buna da bakın:
https://academic.oup.com/….1093/cid/ciaa742/5854652
bu pcr işlemi birkaç saat sürer minimum (yukardaki sebeplere rağmen bile hızlı tanı kitlerinden daha güvenilir). ama tabii örnek alınacak, test merkezine gidecek, sonuçlar çıkacak, sonuçlar yorumlanacak, alıyor 1-2 gün. örneğin alınması ve iletimi de önemli. doğru ortamda saklanmazsa viral rna bozunabilir (o zaman vücudunuzda virüs varsa bile testiniz negatif çıkar), ya da örnek alınan ortam/teçhizat temiz değilse kontaminasyon olabilir (o zaman vücudunuzda virüs yoksa bile pozitif çıkar).
alternatif olarak antikor testi uygulanabilir. kanınıza daha önce koronavirüs girdiyse, bağışıklık sisteminiz bu virüsün proteinlerine karşı antikor geliştirdiyse kanınızda çıkar. aslında protein temelli testler biraz daha güvenilirdir. ama onun da zamanı önemli. virüsle karşılaştıktan sonra yükselen antikor seviyesi zamanla düşebilir.
başka bi alternatif olarak viral kültür yapılabilir. hani bakteriler için yapıyorlar ya, vücudunuzdan örnek alıp bakterilerin mutlu mutlu yaşayabileceği yumuşak bir ortama koyuyorlar. eğer az miktarda bakteri varsa bile başta, sonrasında bölünüp sayısı artıyor, siz de gözlemliyorsunuz. aynı şekil virüs için de yapılabilir. ama ben şimdilik bunu yapan bir yer duymadım türkiye'de.
yine alternatif olarak aşı yapılabilir, o da biraz meşakkatli: